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tg反波胆实验技术

浏览: | 时间:2017年03月08日 | 信息来源:本站原创


大肠杆菌感受态细胞的制备实验

实验方法原理 带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。
实验材料 E. coli DH5α菌株
试剂、试剂盒 LB固体培养基LB液体培养基CaCl2硫酸镁SOBTFB
仪器、耗材 培养皿恒温摇床聚丙烯管电热恒温培养箱台式高速离心机无菌工作台烧瓶恒温水浴锅低温冰箱制冰机分光光度计微量移液枪锥形瓶试管
实验步骤
1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm),转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验,1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
 
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培养物冷却至0℃。
 
3、于4℃用Sorvall GS3特头(或与之相当的转头)以4 100 r/min离心10 min,以回收细胞。
 
4、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
 
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
 
6、于4℃用Sorvall GS3转头(或与之相当的转头)以41 00 r/min离心10 min,以回收细胞。
 
7、倒出培养液,将管倒置1  min以使最后的痕量培养液流尽。
 
8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。
 
9、此时,可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验,也可以将细胞冻存于- 70℃。
 
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注意事项
1.  为达到高效转化,活细胞数务必少于108个细胞/mL,对于大多散大脑杆菌来说,这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高,可每隔15-20 min测定OD600值来监测,用监测的时间及OD值列一个图表,以便预测培养物的OD600值到0.4的时间,当OD600值达到0.35时,收获细菌培养物。
 
2.  在菌株与菌株之间,OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大,因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值,并将各稀释维度的培养物铺于无抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞散,从而使分光光度计读数得到标准化。
 
3.  对大多数大肠杆菌(MC106除外),采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的结果。Dagert和Ehrlieh的实验(1979)曾表明,细胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h,在贮存的最初12-24 h内,转化率增加4-6倍,然后降低到初始水平。
 
4.  克隆的新鲜程度,一定要选新鲜平板的单克隆,即刚涂布生长过夜的平板。
 
5.  菌体的OD600值,JM109或BL21,OD值为0.35,DH5α 为0.4,要尽量保证OD值不要过高,更不能超过0.6。
 
6.  低温处理的时间,做完后冰上保存12-24 h后分装,并保存于-80℃。
 
7.  试剂和用品,所有的用品(离心管、药瓶等)用新的,如果使用旧的,要确保干净,CaCl2溶液。
 


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